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介绍一下Effectene Transfection Reagent(Qiagen)转染步骤

  转染试剂有很多的种类,不同的转染试剂都有不同的优缺点。我们在做实验时需要根据不同的情况选择合适的转染试剂。下面小编介绍一下Effectene Transfection Reagent(Qiagen) 转染步骤。

  Effectene Transfection Reagent(Qiagen) 转染步骤:

  以下步骤适用于在6孔培养板中转染贴壁细胞。起初,每个6孔培养板使用0.4 ug DNA。尽管DNA的数量似乎很少,但足以进行转染。为了获得高的转染效率,必须优化每个细胞系的转染条件。

  1.转染前一天,将5ml含血清和抗生素的培养基等分,使每个6孔培养板含有2-8×105个细胞(取决于细胞类型)。

  2.在正常培养条件下(通常为37°C和5%CO2)培养细胞。转染当天细胞应达到40-80%的融合度。

  3.在转染过程中,用DNA浓度缓冲液(EC缓冲液)稀释1 ug DNA至总体积100 ul(DNA溶解在pH 7-8的TE Buffer中,低DNA浓度:0.1ug / ul)加入3.2 ul增强剂并涡旋1秒钟以混合溶液。

  重要提示:请保持DNA与增强子的比例恒定。

  注意:质粒DNA的质量会显着影响多个转染参数,例如转染效率,细胞增殖和细胞毒性以及结果解释。因此,仅应使用高纯度的DNA。使用HiSpeed,QIAfilter和QIAGEN质粒试剂盒提取和纯化的质粒适用于大多数细胞系的转染。为了获得好的重现性和好的结果,我们建议使用Endofree Plasmid Kit,该试剂盒可以在质粒纯化过程中快速有效地去除细菌内毒素,从而获得好的转染效果。

  4.在室温(15-25°C)下孵育2-5分钟,旋转几秒钟以去除管顶部的液滴。

  5.向DNA-Enhance混合物中添加10ul Effectene转染试剂,反复吸液5次或涡旋振荡10秒以进行混合。

  注意:不必始终将Effectene试剂放在冰上。在室温下放置10-15分钟,而不改变其稳定性。

  6.在室温(15-25℃)下孵育5-10分钟以形成转染复合物。

  7.在孵育过程中,从培养板中轻轻吸出培养基,并用4 ml PBS洗涤细胞一次。向细胞中加入1.6 ml新鲜培养基(其中可能包含血清和抗生素)。

  8.在装有转染复合物的EP管中加入0.6 ml培养基(可以包含血清和抗生素)。移液两次以混合,然后立即将转染复合物逐滴添加至6孔培养板中的细胞。轻轻摇动培养板以均匀分布转染复合体。

  9.在正常培养条件下将细胞和转染复合物孵育适当的时间,直到表达了转染的基因。孵育时间由所用实验和所用基因决定。

  可选:在大多数情况下,无需删除转染复合体。但是,如果观察到细胞毒性,请在转染后6-18小时内除去Effectene-DNA混合物,用PBS洗涤细胞一次,然后加入5 ml新鲜细胞培养基。

  10.在瞬时转染过程中,进一步的实验分析了转染基因的表达。

  用β-gal或cat报告基因转染的重组子通常在转染后孵育24-48小时,以大化转染基因的表达。

  为了稳定转染,在转染后24-48小时将细胞从1:5至1:10传代至合适的选择性培养基。将细胞保持在选择性培养基中,直到发生克隆。

  我们建议为使用的每种细胞系和抗生素建立一条致死曲线(剂量反应曲线)。但重要的是要记住,致死率曲线受细胞密度影响。

  有时需要执行以下步骤:将转染的细胞置于其正常培养基(例如不含选择性抗生素的培养基)中,然后孵育1-2天,然后添加选择性培养基。谢谢你对这文章的浏览阅读,看完这篇文章,你有学到知识吗?如果你想了解更多的内容知识,欢迎关注我们的网站!