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慢病毒实验大多数人会遇到的几个经典问题

  与慢病毒相关的实验可能会遇到成千上万的问题,但是大多数人会遇到一些问题。我们将以问答形式教您如何解决慢病毒实验中经常遇到的问题。谈论细胞感染病毒实验和解决方案中经常遇到的问题。

  1.查找合适的慢病毒感染条件:

  使用不同的致敏剂,不同的细胞数量和病毒颗粒比例进行感染前测试。感染后,选择感染效率为80%左右。感染后,感染状况正常,病毒使用量很小。

  实验重点:

  可以使用不同的预敏试剂进行预测试。传统的Polybrene试剂可以满足部分细胞转染的需要,但是Polybrene具有一定的细胞毒性,不适用于敏感细胞。建议使用细胞毒性低的病毒感染试剂,例如HitransG病毒感染试剂;

  使用不同的细胞数量与病毒颗粒数量比率进行预测试;

  选择好的感染条件作为感染条件,感染效率约为80%,感染后细胞状态正常,使用的病毒量少。

  2.选择正确的单元格

  在进行病毒感染时,除了使用适当的感染条件外,更重要的是使用处于正常细胞状态的对数生长期的细胞,以确保细胞在感染病毒后能够顽固地存活。

  另外,细胞应优选具有STR分型和支原体污染的检测。对于新购买的细胞,应当使用支原体检测试剂盒进行检测。如果在培养过程中发现支原体污染,则可以使用支原体去除试剂盒消除细胞中的支原体。

  3.选择合适的荧光波长

  不同的荧光团使用不同的发射波长。三种常见荧光的信息如下:

  GFP激发波长488发射波长507

  RFP激发波长563发射波长582

  mCherry激发波长587发射波长610

  表达病毒感染后,qPCR未检测到过表达作用的原因

  一:细胞靶基因的内源性表达水平过高很可能会影响外源性表达。建议选择低表达细胞系。

  二:引物设计问题,过表达构建体均为CDS区域,因此必须在CDS区域设计引物以检测外源过表达

  细胞感染效率越高,越好

  感染后,感染效率达到80%后,细胞即可进入下游实验,感染效率不必达到100%。