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转染试剂厂家给大家介绍两种不同的转染步骤

  DNA转染技术的发展对现代分子生物学产生了巨大的影响。基因转染技术不仅是研究转基因和基因表达的重要工具,而且是目前基因治疗的关键步骤。下面转染试剂厂家给大家介绍两种不同的转染步骤。

  FuGENE6(Roche)转染步骤:

  转染前一天将细胞分至培养板,转染当天细胞应50-80%融合。将细胞以1-3×105/2 ml接种于6孔板后孵育隔夜将达到如此密度。

  将FuGENE6 Reagent在室温孵育10-15分钟。使用之前将FuGENE6颠倒混匀一下。

  1. 在PCR管中加入不含血清和双抗的营养液以稀释FuGENE6,直至总体积到100 ul。

  2. 将3-6 ul FuGENE6 Reagent直接加入营养液,轻弹管壁混合。

  3. 加入1-2 ug的DNA溶液(0.02-2.0 ug/ul),轻弹管壁混合。

  4. 室温孵育20分钟。

  5. 将6孔板中的旧营养液吸出,加入约1 ml不含血清和双抗的营养液洗涤一次,再加入2 ml不含血清和双抗的营养液。

  6. 将转染复合物加入细胞,混匀使之均匀分布。

  7. 3-8小时后,加入血清或换成含血清的营养液。

  Lipofectamine 2000(Invitrogen)转染试剂转染步骤(6孔板):

  1. 转染前一天,胰酶消化细胞并计数,细胞铺板,使其在转染日密度为90-95%。细胞铺板在2 ml含血清,不含抗生素的正常生长的培养基中。

  2. 对于每孔细胞,使用250 ul无血清培养基(如OPTI-MEM I培养基)稀释4.0 ugDNA,轻轻混匀。

  3. 使用前将Lipofectamine 2000转染试剂轻轻混匀,用250 ul无血清培养基(如OPTI-MEM I培养基)稀释10 ul Lipofectamine 2000转染试剂,轻轻混匀。Lipofectamine 2000稀释后,在5分钟内同稀释的DNA混合(<30分钟)。

  4. 混合稀释的DNA(第二步)和稀释的Lipofectamine 2000(第三步)。室温放置20分钟。

  5. (optional)将6孔板中的旧营养液吸出,用无血清培养基清洗两次。加入2 ml无血清配养基。

  6. 直接将复合物加入到每孔中,摇动培养板,轻轻混匀。

  7. 在37℃,5%CO2中保温24-48小时。无需去掉复合物或更换培养基。

  或者在4-5小时后更换培养生长基也不会降低转染活性。

  8. 在细胞中加入复合物24-72小时后,分析细胞抽提物或进行原位细胞染色,检测报告基因活性。这依赖于细胞类型和启动子活性。对稳定表达,在开始转染一天后将细胞传代至新鲜培养基中,两天后加入筛选抗生素。进行稳定表达需要数天或数周。

  注意:我们推荐对每一细胞系和使用的抗生素建立一个致死曲线(剂量-反应曲线)。但是一定要记住致死曲线受细胞密度的影响。

  以下步骤有时是必须的:将转染的细胞置于它们正常的培养液(如:不含选择性抗生素的培养液),然后孵育1-2天,然后再加入选择性培养液。

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