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RNAFit RNA专用转染试剂说明

  RNAFit是一种功能强大的siRNA / miRNA转染试剂,可确保在哺乳动物细胞中进行有效的转染和基因沉默,并且具有高重复性的结果。在绝大多数的细胞(如HeLa,MCF7或NIH-3T3)中使用RNAFit转染1 nM siRNA,就能达到超过90%的转染效率;对于难以转染的悬浮细胞系如K562或THP-1细胞,使用RNAFit转染终浓度为5 nM的siRNA,也可以观察到超过80%的转染效率。

  1、贴壁细胞转染siRNA操作步骤

  1.1接种细胞

  为了使用RNAFit转染贴壁细胞取得非常好的转染效果,需要提前一天将细胞接种到相应的培养板中,以转染时细胞汇合度达到30-50%为宜。

  1.2 贴壁细胞转染

  为了达到高的基因沉默效率,我们建议siRNA浓度范围为1 nM至10 nM,因为siRNA浓度和靶基因本身、细胞类型、siRNA效力、靶mRNA的半衰期等有很大关系。需要注意的是,在较低的siRNA浓度下,脱靶率通常非常低。 RNAFit的用量应根据siRNA浓度和培养皿规格进行调整,见表2。

  注意:

  1.转染前确认好 siRNA 的大小和纯度。

  2.避免 RNase 污染,微量 RNase 就会导致 siRNA 实验失败。需要使用无RNase的耗材及试剂,保证实验每个步骤不受RNase污染非常重要。

  1.2.1转染1nM siRNA的操作步骤

  以下步骤用于在24孔板中转染1nM siRNA双链体,如使用其他规格的培养皿进行转染,可参见表2。

  1)将0.6 pmoles(8.4 ng)的siRNA双链体稀释到100 μl无血清的培养基中或Opti-MEM中,用移液枪轻轻吹打 3~5 次混匀。

  2)向上述100 μl 含siRNA的培养基中加入2μl RNAFit。

  3)加入RNAFit后立即涡旋振荡10秒钟,进行混匀。

  4)在室温下孵育10分钟,使siRNA双链体和RNAFit之间形成转染复合物,不要超过30分钟。

  5)在转染复合物形成期间,吸弃培养皿中原有的培养基,并向每孔中重新加入0.5 ml预热的新鲜的完全培养基。

  6)将步骤4中的100 μl转染复合物加入 24 孔细胞板中,前后轻摇细胞板混合均匀。每孔中培养基的体积为600 μl,siRNA终浓度为1nM。

  7)细胞板置于 37℃、5% CO2培养箱中培养。

  8)转染完成后 24~72 小时均可通过 qPCR 和Western Blot 进行 siRNA 沉默效果检测。

  2、悬浮细胞转染siRNA操作步骤

  2.1接种细胞

  为了使用RNAFit转染悬浮细胞取得非常好的转染效果,与常规培养条件相比,应在转染当天减少培养基体积接种细胞。对于不同规格的培养板,建议接种的细胞数量及完全培养基体积。

  2.2悬浮细胞转染

  为了达到高的基因沉默效率,我们建议对siRNA浓度从5 nM至20 nM范围进行摸索,需要相应地调整RNAFit的体积。

  以下步骤用于在24孔板中转染5nM siRNA双链体,如使用其他规格的培养皿进行转染,可参见表6。

  1)将1.5 pmoles(21 ng)的siRNA双链体稀释到100 μl不含血清的培养基中或Opti-MEM中,移液枪轻轻吹打3~5 次混匀。

  2)向上述100 μl 含siRNA的培养基中加入4μl RNAFit。

  3)立即涡旋振荡10秒钟,进行混匀。

  4)在室温下孵育10分钟,使siRNA双链体和RNAFit之间形成转染复合物,不要超过30分钟。

  5)将步骤4中的100 μl转染复合物加入 24 孔细胞板中,每孔中细胞悬液为200 μl,前后轻摇细胞板混合均匀。每孔中培养基的体积为300 μl,siRNA终浓度为5 nM。

  6)细胞板置于 37℃、5% CO2培养箱中培养。

  7)转染完成后 24~72 小时均可通过 qPCR 和Western Blot 进行 siRNA 沉默效果检测。