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Superfect Transfection Reagent(Qiagen) 转染步骤

  转染技术是指将外来分子(例如DNA和RNA)引入真核细胞。它是研究基因表达调控和突变分析的常规工具。随着功能研究的兴起,其应用越来越广泛。以下是转染试剂Superfect Transfection Reagent(Qiagen)的转染步骤:

  以下步骤适用于在6孔培养板中转染贴壁细胞。为了获得高的转染效率,必须优化每个细胞系的转染条件。

  1.转染前一天,等分含有血清和抗生素的培养基,以使每个6孔培养板均含有2-8×105个细胞(取决于细胞类型)。

  2.在正常培养条件下(通常为37°C和5%CO2)培养细胞。转染当天细胞应达到40-80%的融合度。

  3.在转染过程中,用无血清培养基将2 ug DNA稀释至总体积100 ul(DNA溶解在pH 7-8的TE Buffer中,小DNA浓度为0.1 ug / ul)。混合并离心几秒钟以除去管顶部的液滴。

  注意:质粒DNA的质量会显着影响多个转染参数,例如转染效率,细胞增殖和细胞毒性以及结果解释。因此,仅应使用高纯度的DNA。使用HiSpeed,QIAfilter和QIAGEN质粒试剂盒提取和纯化的质粒适用于大多数细胞系的转染。为了获得很好的重现性和结果,我们建议使用Endofree Plasmid Kit,该试剂盒可以在质粒纯化过程中快速有效地去除细菌内毒素,从而获得很好的转染效果。

  4.向DNA稀释液中添加10 ul Superfect Transfection Reagent,通过移液5次或涡旋10秒重复混合。

  注意:没有必要将Superfect试剂始终保持在冰上。在室温下放置10-15分钟,而不改变其稳定性。

  5.在室温(15-25°C)下孵育5-10分钟以形成转染复合体。

  6.在孵育过程中,从培养板上轻轻吸出培养基,并用2ml PBS洗涤细胞一次。

  7.在装有转染和转染复合物的EP管中加入600ul培养基(含血清和抗生素)。通过移液两次混合,然后立即将转染复合物添加到6孔培养板的细胞中。轻轻摇动培养板以均匀分布转染复合体。

  8.在正常培养条件下将细胞和转染复合物孵育2-3小时。

  9.小心取出Superfect-DNA混合物,并用2 ml PBS洗涤细胞3-4次

  10.加入新鲜的普通培养基,孵育24-48小时。

  11.在瞬时转染过程中,进一步的实验分析了转染基因的表达。

  用β-gal或cat报告基因转染的重组子通常在转染后孵育24-48小时,以大化转染基因的表达。

  为了稳定转染,细胞在转染后24-48小时从1:10到1:15传至合适的选择性培养基。将细胞保持在选择性培养基中,直到发生克隆。

  注意:我们建议为使用的每种细胞系和抗生素建立一条致死曲线(剂量反应曲线)。但重要的是要记住,致死率曲线受细胞密度影响。

  有时需要执行以下步骤:将转染的细胞置于其正常培养基(例如不含选择性抗生素的培养基)中,然后孵育1-2天,然后添加选择性培养基。