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Superfect Transfection Reagent(Qiagen) 转染步骤

  适用于把质粒、siRNA或其他形式的核酸包括DNA、RNA、寡核苷酸转染到真核细胞中,具有转染效率高、细胞毒性非常小的优势。下面转染试剂厂家的小编详细讲解一下。

  Superfect Transfection Reagent(Qiagen) 转染步骤:

  以下步骤适用于在6孔培养板中转染贴壁细胞。如果想获得非常高的转染效率,对每种细胞系的转染条件都要进行优化。

  1. 转染前一天,用含血清和抗生素的培养基分装使每6孔培养板含2-8×105的细胞(根据细胞类型而定)。

  2. 在细胞的正常培养条件下培养(通常37℃和5%CO2)。转染当天细胞应40-80%融合。

  3. 转染时,用无血清培养基稀释2 ug DNA至100 ul总体积(DNA用pH 7-8的TE Buffer溶解,DNA非常低浓度:0.1 ug/ul)。混合,离心几秒钟以从管顶去除液滴。

  注意:质粒DNA的质量会显著影响几个转染参数如转染效率、细胞增殖和细胞毒性、以及对于结果的解释。因此,只应该使用非常高纯度的DNA。使用HiSpeed,QIAfilter和QIAGEN Plasmid Kits抽提纯化的质粒适合于大多数细胞系的转染。要获得很好的重复性和很好的结果,我们推荐使用Endofree Plasmid Kit,该试剂盒可以快速有效地在质粒纯化过程中去除细菌内毒素,从而获得非常好的转染结果。

  4. 向DNA稀释液中加入10 ul Superfect Transfection Reagent,反复吸取5次或涡旋10秒钟以混合。

  注意:没必要一直把Superfect Reagent置于冰上。在室温中放置10-15分钟不会改变它的稳定性。

  5. 室温下(15-25℃)孵育5-10分钟以形成转染复合物。

  6. 孵育过程中,从培养板上轻柔地吸出培养液,用2ml PBS洗涤一次细胞。

  7. 加入600 ul培养液(包含血清和抗生素)至包含转染转染复合物的EP管中。吹打两次以混合,立即将转染复合物加入6孔培养板的细胞中。轻摇培养板使转染复合物分布均匀。

  8. 将细胞与转染复合物在它们的正常培养条件下孵育2-3小时。

  9. 小心移除Superfect-DNA混合物,用2 mlPBS洗涤3-4次细胞

  10. 加入新鲜的正常培养基,孵育24-48小时。

  11. 瞬时转染时,进一步试验分析转染基因的表达。

  转染β-gal 或 cat 报告基因的重组子常在转染后孵育24-48小时以使转染基因的表达大化。

  稳定转染时,在转染后24-48小时,将细胞以1:10~1:15传代至合适的选择性培养基中。保持细胞在选择性培养基中直至克隆出现。

  注意:我们推荐对每一细胞系和使用的抗生素建立一个致死曲线(剂量-反应曲线)。但是一定要记住致死曲线受细胞密度的影响。

  以下步骤有时是必须的:将转染的细胞置于它们正常的培养液(如:不含选择性抗生素的培养液),然后孵育1-2天,然后再加入选择性培养液。