环状RNA
环状RNA（Circular RNA，简称circRNA）是一类具有闭合环状结构的单链RNA分子，由线性RNA的5’端和3’端反向剪接形成。与线性RNA不同，环状RNA没有5’和3’的自由末端，因此具有更高的稳定性，不易受到外切酶的降解。虽然环状RNA最初被认为是剪接过程中的错误产物，但后续研究发现它们在细胞内具有多种重要的生物学功能。例如，它们可以作为miRNA的海绵（sponge），吸附miRNA从而调节miRNA的活性；它们还可能参与调控基因表达、影响细胞增殖和分化等过程。
尽管大多数天然环状RNA是非编码RNA，不能翻译成蛋白质，但研究表明带有IRES序列的环状RNA在体内、体外都可以翻译成蛋白质。能够翻译成蛋白质的环状RNA被称为环状mRNA。与传统的线性mRNA相比，环状mRNA由于缺乏5’端帽子结构和3’端的Poly(A)尾巴，因此对核酸外切酶的降解具有抵抗力，表现出更高的稳定性。这种独特的结构使得环状mRNA在细胞内能够更持久地表达蛋白质，为基因治疗和疫苗开发等领域提供了新的机遇。
图1 成熟的mRNA剪接和相应的circRNA的典型生物发生
图源：Alyaa Dawoud, Circular RNAs: New layer of complexity evading breast cancer heterogeneity. Non-coding RNA Research, Volume 8, Issue 1, 2023, 60-74,
环状RNA的体外合成方式
化学法：
化学法的体外合成环状RNA主要依赖于磷酰胺化学和固相合成技术，这一过程使用核苷三磷酸酯衍生物作为原材料，并通过特定的保护基团来防止不希望发生的化学反应，从而实现3’-5’磷酸二酯键的形成。尽管这种方法能够精确控制RNA序列的合成，但它通常受限于较短的RNA长度，一般只能合成少于70~80个核苷酸的环状RNA。
酶促合成与连接：
该方法利用酶催化反应来形成环状RNA，主要涉及T7 RNA聚合酶介导的体外转录（IVT），和T4连接酶或核酶介导的环化。
T4 连接酶需要线性RNA前体上有游离的3’-OH和 5’单磷酸才能进行。T4 DNA连接酶（T4 Dnl）和T4 RNA连接酶1（T4 Rnl 1）特别适合于那些没有复杂二级结构的RNA分子的环化，而T4 RNA连接酶2（T4 Rnl 2）则更擅长处理那些接头区域形成双链结构的RNA前体，这要求研究人员在选择合成策略时必须考虑RNA前体的结构特性。然而，尽管这些酶在合成环状RNA方面各有优势，它们在处理大型RNA分子时仍存在局限性，且无法完全消除可能导致低产率的分子间末端连接副反应。
核酶法是一种利用具有催化活性的RNA分子来促进RNA环化的技术。这种方法中，最为人熟知的是PIE系统，它依托于I型或II型内含子的自我剪接能力。PIE系统在反应中需要镁离子和GTP的存在，这些条件激活了内含子的催化活性，使得内含子能够自我剪接并连接周围的RNA序列，最终生成环状RNA。本公司的环状RNA体外制备服务基于I型内含子PIE系统。
环状mRNA的应用
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- 基因治疗：环状mRNA作为一种稳定的基因表达载体，可以在不整合入宿主基因组的情况下提供持久的治疗效果。环状mRNA的半衰期比线性mRNA长，意味着它可以在细胞内提供更长时间的基因表达，减少治疗频率。相比于其他基因载体（如某些病毒载体），环状mRNA引发的免疫反应较低，降低了治疗过程中的副作用风险。通过设计特定的启动子和调控元件，可以实现对环状mRNA表达的精确调控，提高治疗的针对性。
- 疫苗开发：环状mRNA的高稳定性使其在疫苗生产、储存和运输过程中保持结构和功能的完整性，提高了疫苗的实用性。环状mRNA能够持续表达抗原蛋白，从而提供持久的免疫刺激，增强疫苗的免疫原性。与使用活病毒或减毒病毒的疫苗相比，基于环状mRNA的疫苗不涉及活病原体，降低了潜在的感染风险。
- 蛋白质生产：在生物制药和生物材料行业中，环状mRNA可以作为一种高效、稳定的方法来生产重组蛋白。环状mRNA的稳定性和长期表达特性使得它在细胞工厂或生物反应器中能够持续产生大量的蛋白质。天津工业生物技术研究所毕昌昊研究员就曾带领其团队利用体外制备的环状mRNA在大肠杆菌系统表达成功表达了MaSp1和FSLP两种重组蛛丝蛋白，产量分别超过20 mg/mL和80 mg/mL。
