环状RNA和表达载体
环状RNA（Circular RNA，简称circRNA）是一类具有闭合环状结构的单链RNA分子，由线性RNA的5’端和3’端反向剪接形成。与线性RNA不同，环状RNA没有5’和3’的自由末端，因此具有更高的稳定性，不易受到外切酶的降解。虽然环状RNA最初被认为是剪接过程中的错误产物，但后续研究发现它们在细胞内具有多种重要的生物学功能。例如，它们可以作为miRNA的海绵（sponge），吸附miRNA从而调节miRNA的活性；它们还可能参与调控基因表达、影响细胞增殖和分化等过程。
尽管大多数天然环状RNA是非编码RNA，不能翻译成蛋白质，但研究表明带有IRES序列的环状RNA在体内、体外都可以翻译成蛋白质。能够翻译成蛋白质的环状RNA被称为环状mRNA。与传统的线性mRNA相比，环状mRNA由于缺乏5’端帽子结构和3’端的Poly(A)尾巴，因此对核酸外切酶的降解具有抵抗力，表现出更高的稳定性。这种独特的结构使得环状mRNA在细胞内能够更持久地表达蛋白质，为基因治疗和疫苗开发等领域提供了新的机遇。
GeneCopoeia 使用 Gateway 克隆技术与自有的 circRNA 载体，构建出最适合基因表达的 circRNA。我们提供超过 35,000 个经过序列验证的人类和小鼠 ORF，可快速转入 circRNA 载体。这项技术缩短了克隆构建所需的时间，省去了繁琐、耗时的多步骤亚克隆过程，包括酶切、连接、凝胶电泳和纯化。
环状RNA的体外合成方式
环状 RNA 在体内的广泛存在以及对其结构和功能特性的研究，使得人们需要能在体外高效制备环状 RNA 的方法。目前已有多种方法，如化学连接/合成法、利用 T7 RNA 体外转录、T4 DNA 连接酶和 T4 RNA 连接酶、以及 Ribozyme 法进行酶连接。
Genecopoeia 应用 I型内含子PIE系统 环化方法，结合 Gateway 克隆技术、高质量的人和小鼠穿梭 ORF Entry 克隆以及 T7 RNA 聚合酶来产生环状 mRNA。
环状mRNA的应用
-
- 基因治疗：环状mRNA作为一种稳定的基因表达载体，可以在不整合入宿主基因组的情况下提供持久的治疗效果。环状mRNA的半衰期比线性mRNA长，意味着它可以在细胞内提供更长时间的基因表达，减少治疗频率。相比于其他基因载体（如某些病毒载体），环状mRNA引发的免疫反应较低，降低了治疗过程中的副作用风险。通过设计特定的启动子和调控元件，可以实现对环状mRNA表达的精确调控，提高治疗的针对性。
- 疫苗开发：环状mRNA的高稳定性使其在疫苗生产、储存和运输过程中保持结构和功能的完整性，提高了疫苗的实用性。环状mRNA能够持续表达抗原蛋白，从而提供持久的免疫刺激，增强疫苗的免疫原性。与使用活病毒或减毒病毒的疫苗相比，基于环状mRNA的疫苗不涉及活病原体，降低了潜在的感染风险。
- 蛋白质生产：在生物制药和生物材料行业中，环状mRNA可以作为一种高效、稳定的方法来生产重组蛋白。环状mRNA的稳定性和长期表达特性使得它在细胞工厂或生物反应器中能够持续产生大量的蛋白质。有文献报道利用体外制备的环状mRNA在大肠杆菌表达系统中成功表达了MaSp1和FSLP两种重组蛛丝蛋白，产量分别超过20 mg/mL和80 mg/mL（Ref.）。
