HaloTag® 技术

带有HaloTag®的表达载体列表

图1. 带N-或C-端HaloTag®的OmicsLink即用型ORF表达克隆载体 图

How it works

图2. HaloTag®融合蛋白能特异地与报告子和配体共价结合，可以检测和固定标签蛋白

HaloTag®技术的应用

蛋白定位

过膜或是不过膜的HaloTag®配体都可以标记胞内和膜上的蛋白。这些被标记的蛋白可以使用荧光显微镜来观察 (Figure 1). 不能过膜的荧光染料可用于带有HaloTag®的膜蛋白的标记

图3. 用三个不同配体标记HaloTag® 融合蛋白。  HeLa细胞瞬时转染HaloTag® pHT2 表达克隆，使用5 μM HaloTag® TMR 配体 (Panel A); 10μM HaloTag® diAcFAM Ligand (Panel B);  25 μM HaloTag® Coumarin Ligand (Panel C).

蛋白共定位

如果加了配体后固定HaloTag®融合蛋白的表达细胞，这些细胞可以进一步使用免疫化学实验对蛋白进行共定位(Figure 2)。抗 HaloTag® 的多克隆抗体也可以和其他抗体共同使用来进行共定位研究。

图4. 固定表达 p65-HaloTag® 融合蛋白（使用HaloTag® TMR配体和抗体标记）的细胞。HeLa细胞瞬时转染p65-HaloTag®后使用TMR配体染色在37℃染色15分钟。随后使用1 μg/ml小鼠Anti-βIII微管蛋白固定细胞，使用Alexa Fluor 488-conjugated 二次孵育。 Panel A: TMR fluorescence. Panel B. Alexa Fluor-488 fluorescence. Panel C: Overlaid Alexa Fluor™-488 and TMR fluorescence and transmitted light. Panel D: Overlaid AlexaFluor-488 and TMR fluorescence. Please refer to Promega’s manual TM260 for this application.

使用多重脉冲追踪标记研究蛋白转运

使用不同的荧光配体可以在不同时间标记活细胞内的HaloTag®融合蛋白(Figure 3).详情参看Promega TM260使用说明。

图5. 使用HaloTag®技术示踪蛋白。标记细胞0小时和12小时的显影显示这些标记的蛋白从细胞质移动到细胞膜。详细信息请参看 Svendsen, S., et al., (Promega Notes 95 (2007) 16–19).

蛋白富集, SDS-PAGE和western blot分析

使用生物素配体和固定的亲和素可以用于HaloTag®融合蛋白的纯化、酶切验证、质谱分析或转录后修饰。使用荧光配体标记的HaloTag® 融合蛋白可以通过SDS-PAGE和 western blot分离(Figure 4).

图6. 快速、高效、特异地标记哺乳动物细胞表达的HaloTag®蛋白。泳道1–6为CHO-K1对照细胞，泳道7–12为瞬时转染HaloTag® pHT2表达克隆的细胞，使用5 μM HaloTag® TMR Ligand  在37°C分别孵育0.5、1、2、5、15和30分钟.蛋白使用SDS-PAGE分离，通过Hitachi FMBIO® 荧光扫描仪分析。

HaloTag®是Promega公司专利产品，本公司获得授权使用，此页面的所有数据的使用都得到了Promega的允许。