简介
HaloTag®是活细胞和固定细胞多色细胞成像实验的首选系统。这种多功能标签可以特异地与多种配体共价结合，能够在体内体外方便地对标签蛋白加荧光基团和纯化。
HaloTag®也能提高蛋白的表达量和可溶性，因此可以用于许多下游应用。
技术
HaloTag®标签蛋白是一种脱卤素酶的遗传修饰衍生物，可与多种合成的HaloTag®配体有效地共价结合。这个分子量为33KDa的单体蛋白能融合在重组蛋白的N端或C 端，并在原核或真核系统中表达。
与OmicsLink™即用型表达克隆结合使用
GeneCopoeia提供带有HaloTag®、CMV启动子、新霉素筛选标记的哺乳动物细胞和慢病毒的表达载体。 可以订购带有HaloTag®标签的20,000多种人和15,000多种小鼠的基因。
特异性
HaloTag®融合蛋白能特异地与报告子和配体共价结合，可以检测和固定标签蛋白。点击查看GeneCopoeia可以提供的报告基因和配体列表
严格的质检和质量保证
OmicsLink clone collection里的所有ORF表达克隆源于验证过的全长cDNA克隆或高质量的人源cDNA组织文库。
寄送之前，GeneCopoeia对所有的克隆进行了严格的质检过程。
- 所有的ORF经过全长测序
- 通过PCR验证序列长度
- 通过酶切验证质粒的正确性
应用实例
HaloTag®技术的应用
蛋白定位
过膜或是不过膜的HaloTag®配体都可以标记胞内和膜上的蛋白。这些被标记的蛋白可以使用荧光显微镜来观察 (Figure 1). 不能过膜的荧光染料可用于带有HaloTag®的膜蛋白的标记
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图3. 用三个不同配体标记HaloTag® 融合蛋白。 HeLa细胞瞬时转染HaloTag® pHT2 表达克隆，使用5 μM HaloTag® TMR 配体 (Panel A); 10μM HaloTag® diAcFAM Ligand (Panel B); 25 μM HaloTag® Coumarin Ligand (Panel C).
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蛋白共定位
如果加了配体后固定HaloTag®融合蛋白的表达细胞，这些细胞可以进一步使用免疫化学实验对蛋白进行共定位(Figure 2)。抗 HaloTag® 的多克隆抗体也可以和其他抗体共同使用来进行共定位研究。
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图4. 固定表达 p65-HaloTag® 融合蛋白（使用HaloTag® TMR配体和抗体标记）的细胞。HeLa细胞瞬时转染p65-HaloTag®后使用TMR配体染色在37℃染色15分钟。随后使用1 μg/ml小鼠Anti-βIII微管蛋白固定细胞，使用Alexa Fluor 488-conjugated 二次孵育。 Panel A: TMR fluorescence. Panel B. Alexa Fluor-488 fluorescence. Panel C: Overlaid Alexa Fluor™-488 and TMR fluorescence and transmitted light. Panel D: Overlaid AlexaFluor-488 and TMR fluorescence. Please refer to Promega’s manual TM260 for this application.
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蛋白-DNA相互作用
起固定作用的配体(例如HaloLink™ Resin) 可以将HaloTag® 融合蛋白交联到DNA。这样就不用像经典的染色体免疫共沉淀(ChIP)实验那样使用抗体。详情请参考Promega #TM075的使用说明。
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使用多重脉冲追踪标记研究蛋白转运
使用不同的荧光配体可以在不同时间标记活细胞内的HaloTag®融合蛋白(Figure 3).详情参看Promega TM260使用说明。
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图5. 使用HaloTag®技术示踪蛋白。标记细胞0小时和12小时的显影显示这些标记的蛋白从细胞质移动到细胞膜。详细信息请参看 Svendsen, S., et al., (Promega Notes 95 (2007) 16–19).
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蛋白富集, SDS-PAGE和western blot分析
使用生物素配体和固定的亲和素可以用于HaloTag®融合蛋白的纯化、酶切验证、质谱分析或转录后修饰。使用荧光配体标记的HaloTag® 融合蛋白可以通过SDS-PAGE和 western blot分离(Figure 4).
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图6. 快速、高效、特异地标记哺乳动物细胞表达的HaloTag®蛋白。泳道1–6为CHO-K1对照细胞，泳道7–12为瞬时转染HaloTag® pHT2表达克隆的细胞，使用5 μM HaloTag® TMR Ligand 在37°C分别孵育0.5、1、2、5、15和30分钟.蛋白使用SDS-PAGE分离，通过Hitachi FMBIO® 荧光扫描仪分析。
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HaloTag®是Promega公司专利产品，本公司获得授权使用，此页面的所有数据的使用都得到了Promega的允许。
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