简介 生物素连接酶 (Biotin-Protein Ligase)由birA基因编码所得， 能活化生物素形成生物素酰 -5′-腺苷酸，将生物素特异地转移到生物素受体标签蛋白（如AviTag 融合蛋白）上，使标签蛋白生物素化，也可用作生物素操纵子阻碍物。又名为：生物素操纵子阻碍蛋白(biotin operon repressor protein)、birA、生物素酶合成酶(biotin holoenzyme synthetase)、生物素-乙酰辅酶a羧化酶合成酶(biotin-[acetyl-CoA carboxylase] synthetase)。
来源： 大肠杆菌 E. coli
储存缓冲液： 50 mM咪唑；50 mM氯化钠；5%甘油；5 mM巯基乙醇；pH 6.8
储藏条件： 本产品以干冰运送，送达后应立即分装储存于-80°C。长期保存置于-80℃，短期内使用置于-20℃，频繁使用可短时置于4℃。在4℃条件下保存三个月可保持>90% Ligase Buffer A、B和D-Biotin储存于-20℃，可反复冻融。
活性单位： ≥7500 Units/μg
纯度： ＞95%
酶活性单位定义： 底物蛋白（多肽）浓度为40 µM的条件下，于30℃孵育30 min，将 1 pmol蛋白（多肽）生物素化所需的酶量定义为一个活性单位。
产品使用指导 产品使用指导
根据具体情况，应视乎反应体系添加生物素连接酶 量，使生物素酰化在一合理的时间区间内进行(如下方图表所示)。通常，每10 nmol(浓度40 µM)底物建议对应2.5 µg 生物素连接酶 ，在30°C下反应30-40分钟，可达到最佳的生物素酰化效果。
需要注意的是，在不同生物缓冲液中存在的不同试剂可能抑制生物素连接酶 活性，包括NaCl(100 mM)、甘油(5%)、硫酸铵(50 mM)。因此在反应体系中，这些试剂的浓度应尽量最小化。我们推荐将反应底物添加于pH 8，10 mM Tris-HCl中。
为提高生物素酰化效率，建议底物在最终反应体系的浓度尽可能高(最高可至40 µM)。反应体系的底物浓度越低，生物素酰化耗时越长。例如在使用同一birA酶的条件下，40 µM的底物反应时长是30分钟，4 µM的同一底物反应时长则为5小时。当生物素酰化过程需控制在30分钟内(例如反应速度提高10倍) ，体系中需添加的酶量为原有酶量的10倍。
Biotin Ligase Buffer A和Biotin Ligase Buffer B 已经过优化，可在底物（15-mer多肽）浓度不高于40 µM的情况下保持最优的生物素酰化效率。如底物浓度为40 – 80 µM，则需按以下内容配制反应体系：1份Buffer A、1份Buffer B、7份底物溶液、1份额外添加的生物素。如所需底物浓度高于80 µM，请致电技术支持：020-32069233。
生物素连接酶的相关菌株 生物素连接酶的相关菌株
AVB100是一种大肠杆菌E. coli K12菌株 [MC1061 araD139 delta(ara-leu)7696 delta(lac)l74 galU galK hsdR2(rK-mK+) mcrB1 rpsL(Strr)]。该菌株的染色体带有稳定转入的birA基因。
在该菌株中，BirA蛋白的过表达可由阿拉伯糖诱导所得。稳定转入的birA基因不需使用抗生素维持。在AVB100使用IPTG诱导的载体如Avidity’s pAC、pAN、pATN 和pATC AviTag载体，可独立调控目的基因及BirA的表达水平。该菌株仅限个人研究使用，不可分销，使用前请阅读产品的相关许可证明。
AVB99是一种带有pACYC184质粒的大肠杆菌E.coli (XL1-Blue)，该质粒包含IPTG诱导的birA基因，可过表达生物素连接酶(pBirAcm)，是一个低拷贝数的质粒。培养含该质粒的菌株可使用10 µg/mL浓度的氯霉素。
AVB101是大肠杆菌E. coli 的B菌株(hsdR, lon11, su1A1)，内含pACYC184质粒，该质粒含有IPTG诱导的birA基因，可过表达生物素连接酶(pBirAcm)。该菌株生长快速且健康，不含添加OmpT或Lon蛋白酶，是理想的蛋白表达工具菌株。
生物素连接酶及AviTag蛋白的表达均由IPTG (1 mM)诱导。诱导阶段必须添加生物素，添加至其终浓度为50 µM。pAN及pAC载体需添加氨苄青霉素维持，抗生素浓度建议为100 µg/mL。
Avidity’s AVB99及AVB101的质粒特性：
质粒骨架为pACYC184；
其中1.3 Kb片段含有插入了EcoRV位点的lacIq(因此可干扰tetR 基因)；
BirA由乳糖启动子操纵子调控表达；
rrnB终止子结构位于laqIq区域，可破坏pACYC184的XbaI位点。
