无需切割 DNA，即可抑制转录
与RNAi等传统基因敲低方法相比，CRISPR干扰（CRISPRi）具有显著优势，包括在DNA水平上对基因进行高度特异性、可逆的沉默，不改变基因组序列。该技术能提供高效的基因抑制，脱靶效应低，且易于实现多基因调控，适用于研究必需基因、非编码RNA和复杂信号通路等领域。
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载体选择
| 对照 | 启动子 | CRISPR option | 筛选标记 / 报告基因 | 载体类型 | 载体图谱 |
|---|---|---|---|---|---|
| pCRISPR-AB04 | U6 | CRISPRi dCas9-KRAB | Puro / mCherry | Lentiviral |  |
技术简介
KRAB系统是最经典的CRISPRi工具，其原理是将 Krüppel-associated box（KRAB）抑制结构域与无核酸酶活性的 dCas9 融合。在 sgRNA 的引导下，dCas9-KRAB 会特异性地结合在目标基因的转录起始位点（TSS）附近。随后，KRAB 结构域招募 KAP1 共抑制蛋白，从而引发一系列表观遗传修饰事件。KRAB-CRISPRi 在必需基因的功能缺失筛选、非编码 RNA 调控研究以及模拟部分药物抑制效应的表型分析中尤为有用。
CRISPRi 系统由2部分组成：
- dCas9-KRAB 融合蛋白：dCas9在sgRNA的引导下结合到目标DNA，其融合的KRAB通过与转录因子共抑制蛋白（如KAP1）结合，招募表观遗传学修饰酶（如组蛋白去乙酰化酶HDAC1/2和组蛋白甲基转移酶），抑制目标基因的转录。
- sgRNA：靶向核心启动子区
应用实例
在 Hela 细胞中同时过表达 dCas9-KARB 和 sgRNA ，用 qPCR 检测了 DPH2 的转录活性。转导了 sgRNA 的细胞扩增曲线为红色，没有转导 sgRNA 的细胞为蓝色，将目的基因的转录水平与 GAPDH 的转录水平进行了比较，表明目的基因在 Hela 细胞中的转录倍数显著抑制。
