miRNA 3′ UTR 克隆

本公司提供两套3'UTR报告载体。在pEZX-MT05载体中，我们将3'UTR序列（来源于公开的基因序列数据库）插入到Gaussia荧光素酶报告基因下游，在哺乳动物细胞中由SV40启动子驱动转录生成Gaussia荧光素酶（Gluc）和3'UTR靶标序列的嵌合mRNA，因此无需裂解细胞实时监测Gluc的表达，研究mRNA-miRNA的相互作用。在相同载体（pEZX-MT05）上带有分泌型碱性磷酸酶（SEAP）报告基因。CMV启动子驱动转录的SEAP作为同质粒内的对照，这种双报告系统可以对多样本常规转染进行精确比较。

pEZX-MT06是Firefly/Renilla双荧光素酶报告载体。3'UTR序列在Firefly（hLuc）荧光素酶报告基因下游，CMV启动子驱动转录的Renilla（hRLuc）作为同质粒内的对照。通过裂解细胞检测hLuc和hRLuc的表达。

图2. 靶标序列（3' UTR）表达克隆中miRNA的抑制作用
已知LIN28基因是miR-125a的靶标。HEK 293细胞转染Lin28 miRNA靶标序列表达克隆（左）或者共转染miR-125a前体miRNA表达克隆（右）。转染24小时后检测GLuc 和内参SEAP活性。仅转染Lin28 miRNA靶标序列表达克隆的细胞中Gluc和SEAP活性之比定为1（左），以此确定共转样本中的比值。如图所示，miR-125a抑制了GLuc-LIN28-3'-UTR克隆中Gluc 70%以上的活性。