产品简介 AccelerRT® 5G Full Length cDNA Synthesis & Amplification Kit能以1 – 1000个细胞或10 pg -100 ng总RNA为模板，以Oligo(dT)VN Primer 为逆转录引物进行cDNA的合成，并且利用5G Template Switching Reverse Transcriptase的末端转移酶活性在cDNA的3’端添加一段接头序列。通过该接头序列进行后续PCR扩增，获得全长cDNA扩增产物，有效避免了cDNA合成过程中的3’偏好性。获得的全长cDNA扩增产物可以进行基因表达差异、可变剪接、融合基因等遗传调控信息分析。
产品优势
高灵敏度：可以简单地从少量细胞或总RNA中检测到低丰度靶标；
高质量的cDNA：双端引物扩增全长cDNA，有效避免5’端和3’端偏好性；
节省时间：裂解和逆转录时间短；
兼容性广：预扩增兼容下游分析的NGS或Real-time PCR。
应用
全长mRNA转录本第一链cDNA的合成；
单细胞测序文库构建；
对于融合基因的发现和检测；
单B细胞（VDJ）序列扩增。
产品性能 全长cDNA合成原理
图1. AccelerRT® 5G Full Length mRNA Amplification Kit全长cDNA合成原理介绍。以Oligo(dT) VN Primer为逆转录引物进行第一链cDNA的合成，并且利用逆转录酶的末端脱氧核苷转移酶 (TdT) 活性(Template-switching)，当逆转录酶到达RNA模板的5’端时，TdT活性在cDNA 3’端加上几个不依赖于模版的C碱基。在模板转换步骤，使用Template-switching oligo模板转换引物合成cDNA的第二链，最后，用 5’端 TSO 特异性引物和 3’端通用接头引物进行PCR扩增以获得全长cDNA产物。
有效进行基因全长cDNA扩增
有效进行基因全长cDNA扩增（细胞RNA样品）
图2A. 10ng Hela细胞RNA经AccelerRT® 5G Full Length cDNA Synthesis & Amplification Kit进行全长cDNA逆转录，对22个基因的cDNA产物和PCR产物进行qPCR定量分析。
有效进行基因全长cDNA扩增（细胞样品）
图2C. 1000个Hela细胞经AccelerRT® 5G Full Length cDNA Synthesis & Amplification Kit裂解后进行全长cDNA逆转录，对22个基因的cDNA产物和PCR产物进行qPCR定量分析。
高效抗抑制性
图3. 使用AccelerRT® 5G Full Length cDNA Synthesis & Amplification Kit，在不同抑制剂条件下对Hela total RNA分别反转录，随后使用BlazeTaq™ SYBR® Green qPCR mix 2.0(Cat.# QP031)进行qPCR扩增。
* IP protected and AccelerRT® 5G Trademark owned by GeneCopoeia, Inc.
FAQ 1. 在AccelerRT® 5G Full Length cDNA Synthesis & Amplification Kit使用过程中，纯化操作在预扩增步骤之后是必须的吗？
A： 通过NGS进行下游分析的实验，需要对预扩增后的PCR产物进行纯化，去除可能影响文库制备的残留引物、核苷酸和酶。同样，如果用预扩增后的PCR产物进行qPCR分析，也需要对预扩增后的PCR产物进行纯化，再进行qPCR实验。而对RT反应后的cDNA产物进行qPCR分析，可不进行纯化，但注意cDNA样品加入的体积不能超过反应体系的1/10。
2. 该试剂盒是否适用于降解的样本或FFPE样本？
A： 可以，本试剂盒设计用于全长cDNA预扩增。它以oligo (dT)为基础，为了获得全长cDNA，推荐使用高质量完整的poly(A) RNA。
3. RNA样本是否需要对rRNA的清除和mRNA的富集？
A： 不需要。因为在本试剂盒中只有poly(A) RNA才会被扩增。
4. 预扩增的循环数应如何选择？
A： 根据Hela cell以及Hela total RNA摸索的PCR扩增循环数，仅供参考。不同细胞或RNA的表达情况不一样，因此最适的循环数需要自行做进一步摸索。扩增循环数过高会造成PCR扩增的偏好性，导致DNA文库量下降，扩增循环数过低，会导致DNA量不足，影响后续建库分析。
5. 使用该试剂盒进行全长cDNA扩增，对样本有什么要求吗？
A： 1）细胞样品
准备新鲜的哺乳动物细胞，细胞悬浮于PBS溶液中，细胞可直接使用本产品中的裂解液进行裂解。该产品不适用于经甲醛、丙酮等固定过的细胞。由于本试剂盒是以Oligo dT为引物进行反转录，因此不适用于不含Poly A尾的样本。
2）RNA样品
为了获得最佳结果，请使用高质量的Poly(A) RNA和完整性高且纯度高的总RNA样本。请确保RNA不含污染物，如残留的蛋白质、有机溶剂和盐，这些污染物会使RNA降解或者降低酶的活性和敏感性。实验前可用Agilent RNA 6000 Pico Kit对RNA完整性进行评估，建议使用RIN≥8的RNA。
