在CRISPR中活用VividFISH
在基因组编辑中活用GeneCopoeia FISH探针
永生化的哺乳动物细胞系为生物医学和制药研究提供了方便的模型系统，但它们也经常携带3个甚至更多染色体拷贝或基因拷贝（Wistuba等，1998; Burdall等，2003;van Staveren等，2009）。例如，通常使用的人胚胎肾细胞系HEK293就是亚三倍体，染色体核型为64条。而且，绝大部分体外培养的细胞系都不是二倍体， 而是多倍体 。这为要求完全去除内源基因产物的CRISPR应用提出了特殊的挑战。因此，包括基因拷贝数鉴定在内的筛选方法细化对实验室培养的哺乳动物细胞基因组编辑是非常有益的。
GeneCopoeia的 VividFISH™染色体计数探针是在基因组编辑应用中鉴定的靶基因拷贝数的强大工具。在进行基因组编辑实验前使用VividFISH™探针来鉴定目的染色体拷贝数，可以对后续筛选目的修饰阳性克隆有所帮助。为了说明这个概念，GeneCopoeia 使用VividFISH™染色体计数探针对需要进行CRISPR敲除HDAC6基因（位于X染色体）的人滑膜成纤维细胞系MH7A进行了鉴定。我们利用VivdFISH™探针确定了MH7A细胞系携带5个X染色体（图1A）拷贝。这些信息有助于我们筛选出含有5个带有CRISPR介导移码突变的HDAC6 基因拷贝的MH7A单克隆稳定细胞系。
图1.使用VividFISH™染色体计数探针鉴定哺乳动物细胞系中的5拷贝基因敲除。 A.荧光原位杂交（FISH）分析表明，在MH7A细胞中的有5个HDAC65基因的拷贝。未经基因组编辑MH7A细胞（顶部）和二倍体人细胞系HT1080（底部）与识别X染色体（绿色）以及Y染色体（橙色）的VividFISH™探针进行杂交。只有雄性细胞系HT1080与Y染色体探针发生杂交。细胞核用DAPI（蓝色）染色。
B. 转染靶向HDAC6 (NCBI geneID:10013) 基因的GeneHero™ sgRNA表达克隆后后获得的两个MH7A 单克隆细胞系的测序结果。每个克隆都含有5个携带不同移码突变的HDAC6 等位基因。
