Monthly Archives: 十一月 2020

讲解下腺相关病毒安全使用注意事项

  在使用慢病毒时,收到病毒液后若在短期内使用,可将病毒放置于 4℃ 保存(应该一周内使用完);如需长期保存请分装后放置于 -80 ℃ 。下面讲解下腺相关病毒安全使用注意事项。   1)对于与腺病毒有关的实验,请在生物安全柜(BL-2级)中进行操作。   2)处理病毒时,请穿着实验室衣服,口罩和手套,以免使手和手臂上的皮肤暴露。   3)处理病毒时,应特别注意病毒的流出。如果超净工作台在操作过程中被病毒污染,请立即用70%乙醇和1%SDS溶液将其擦拭干净。   4)与病毒接触的吸头,离心管,培养板和培养瓶应浸入84种消毒剂中并均匀处理。   5)如果在实验过程中需要离心,请使用密封良好的离心管,并在必要时用封口膜和离心机密封。......
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慢病毒感染目的细胞步骤及注意事项

  将状态良好的目的细胞接种到24孔板,使细胞浓度为1×105/ml细胞,接种细胞数量因细胞的生长速度而略有不同,一般是保证第二天进行慢病毒感染的时候细胞汇合率介于50%至70%之间。   (二) 病毒感染   1. Polybrene的选择:   Polybrene是带正电的小分子,与细胞表面的阴离子结合,提高慢病毒对细胞的感染效率,通常加入polybrene能提高感染效率2~10倍。   Polybrene有一定的细胞毒性,有的细胞对Polybrene的毒理反应明显,因此细胞感染时是否适合Polybrene需要摸索;不同细胞对Polybrene的敏感度不同,可以用1~10μg/ml的范围筛选合适的浓度,以24h内细胞无明显毒性反应为佳,可参考文献并进行预实验摸索,Polybrene......
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LipoFiter转染试剂操作手册

  LipoFiterTM脂质体转染试剂( LipoFiterTM Liposomal Transfection Reagent )是一种适合于把质粒或其它形式的核酸,以及核酸蛋白复合物转染到培养的真核细胞中的高效阳离子脂质体转染试剂。   LipoFiterTM优点   1、转染效率高,重复性好,操作简单。   2、无明显细胞毒性,用LipoFiterTM转染细胞后,大多数细胞72小时内不更换培养液无明显细胞毒性。   3、LipoFiterTM对于贴壁细胞和悬浮细胞都适用,并且可以用于稳定表达细胞株的筛选。   LipoFiterTM使用说明   1.细胞培养:以293T细胞为例。转染前1天(20-24小时),将约0.4 x 106个细胞(具体细胞数取决于细胞大小和细胞生长速率)铺在6孔板中。细胞融合可以在2天内达......
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原代 T 细胞分离培养及病毒感染操作

  适用于原代T细胞的病毒包括慢病毒,逆转录病毒(mTRv和hRv)以及用于漂浮细胞的腺病毒(Ads)。其中,逆转录病毒感染的细胞具有物种特异性,mTRv适用于小鼠原代T细胞,hTRv适用于人原代T细胞。您可以使用逆转录病毒构建稳定的转染株。专用腺病毒广告对物种不敏感,并且对人,小鼠和其他物种的原代T细胞显示出很高的感染效率。   小鼠脾脏细胞悬液制备   1. 脱颈处死小鼠,腹部朝上正体位暴露小鼠右侧腹部。   2. 75%乙醇消毒,剪开腹部切取脾脏。   3. 将脾脏放入预先放置好cell strainer(FALCON,352350)并已加入5ml 无菌PBS的六孔板或培养皿中。   4. 用无菌注射器柄充分研磨脾脏。   5. 弃掉cell strainer,轻柔吹打......
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浅谈腺病毒的细胞感染特性

  悬浮细胞专用腺病毒针对悬浮细胞的细胞膜特性进行了腺病毒的改造,慢病毒感染体系也进行了相应的优化,非常大地改善对悬浮细胞的感染能力。对贴壁细胞的感染能力无影响,可以通用。   超强感染效率   悬浮细胞专用腺病毒对Jurkat、K562等众多悬浮培养细胞系感染效率接近100%,对血液来源原代细胞,如CD4+ T细胞感染效率可达60%以上。   腺病毒的细胞感染特性:   1)腺病毒不插入细胞基因组,不形成稳定转染;   2)腺病毒的瞬时表达能力一般为2-4周,细胞增殖越快,表达时间越短;   3)由于不会随机插入损伤基因组,相比较慢病毒,腺病毒对体外培养的目的细胞毒性较小,因此可以用较高MOI来感染目的细胞。   4)高滴......
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慢病毒/逆转录病毒实验策略与关键知识点

  慢病毒/逆转录病毒本身的病毒滴度不高,感染细胞时病毒消耗量较大。慢病毒/逆转录病毒感染细胞后会反转录并插入基因组形成稳转,因此慢病毒/逆转录病毒感染一般采用感染少量细胞,然后将细胞放大化培养。而不是直接大量感染。   注意:对于一些传代能力较差的原代细胞,比如BMSC等,建议采用腺病毒感染。   慢病毒/逆转录病毒感染关键知识点   1)细胞准备:在慢病毒/逆转录病毒建立稳定的细胞系之前,请确保目标细胞处于良好状态且无支原体污染。 慢病毒/逆转录病毒感染的非常好的细胞融合率介于40%和60%之间。   2)确定感染细胞的非常好的MOI:MOI(感染倍数)是指每个细胞感染的病毒数量。   慢病毒/逆转录病毒对于不同......
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