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CRISPR/TALEN 插入缺失检测体系

介绍

GeneCopoeia 开发的 IndelCheck™ CRISPR/TALEN 插入缺失检测体系能为您的基因组编辑研究提供强大的助力。 IndelCheck 检测体系主要可用于以下两方面应用:

  • CRISPR sgRNA 或 TALEN 功能验证图 1) :在进行需时较长的基因组编辑项目之前(基因组编辑细胞株通常需时3-6个月,基因组编辑小鼠模型通常需时6-9个月),先进行功能验证预实验能排除剪切效率不佳的 CRISPR sgRNA 或 TALEN设计,节省大量实验时间。
  • 筛选基因敲除或敲入阳性的单克隆细胞株图 2)。
   

优势

  • 简化您的 CRISPR/TALEN 功能验证及基因敲除克隆筛选
  • 靶点序列 PCR 扩增能力强大,无需分离基因组 
  • 优化过的 T7 核酸内切酶 I 检测系统,含阳性对照,易于上手

 

应用 1: CRISPR sgRNA/TALEN 功能验证

图 1. 使用IndelCheck™体系对 CRISPR 或 TALEN 进行功能验证。收集经 CRISPR 或 TALEN 转染的细胞,并针对靶点序列设计引物,使用靶点 PCR 试剂盒(1)扩增经过 CRISPR/TALEN 扩增的靶点序列。所得的 PCR 产物经解链退火生成杂交 DNA 双链产物,其中部分部分可能存在错配,可以被 T7 核酸内切酶 I 试剂盒(2)酶切检出。如果 CRISPR/TALEN 对基因组的编辑功能是阳性的,错配酶切所产生的条带可以通过电泳跑胶观察到。

 

应用 2: 筛选 CRISPR 或 TALEN 介导的基因组修饰

图 2. 使用 IndelCheck™ 体系筛选带有目的基因组修饰的单克隆细胞株。接种经 CRISPR 或 TALEN 转染的细胞并挑取单克隆细胞株,然后针对靶点序列设计引物,使用靶点 PCR 试剂盒(1)扩增经过 CRISPR/TALEN 扩增的靶点序列。左侧的流程用于筛选非同源末端连接(NHEJ)机制介导的基因敲除克隆,利用 T7 核酸内切酶 I 检测试剂盒(2)对靶点 PCR 产物进行错配酶切,检测NHEJ机制引入的插入缺失突变;检测阳性的 PCR 产物通过靶点 PCR 克隆试剂盒(3)装载体送测,对引入的突变进行测序确证。右侧的流程用于鉴别基因敲除或基因敲入修饰,使用靶点 PCR 克隆试剂盒(3)将靶点 PCR 产物装载体送测,检测和确证靶点引入的基因组修饰。

 

以下图片是使用 IndelCheck™ 靶点 PCR 试剂盒及 T7 核酸内切酶 I 检测试剂盒进行的一个典型的功能验证实验的结果:

(A)
    M      –       +
(B)
   M      –        +

图 3. T7 核酸内切酶 I 酶切基因组PCR产物。该基因组经CRISPR-Cas9编辑。 对照细胞(-)的酶切产物应只有一条带,对应没有被切开的基因组PCR产物。转染了有活性的CRISPR-Cas9克隆的实验组(+),酶切产物跑胶出现3条带:1条来自未被编辑的细胞的基因组PCR产物,其余两条较短的条带为长度符合预期的错配酶切产物。 

 

图 4. Smart-Join™ Blunt-end PCR Cloning Kit的性能比较。 将多组不同长度的PCR产物进行连接反应并转化涂板,然后检测菌落总数和阳性率。 显示SmartJoin™ Target Site PCR Cloning Kit(GeneCopoeia, Cat.No.IC007)的连接效率与Zero Blunt™ PCR Cloning Kit(Thermo Fisher, Cat.No.K275020)相当。

 

                                

图 5. 多组Control Insert连接产物凝胶电泳图