模板转换功能原理

图1. Template Switching RT酶模板转换原理介绍。以Oligo(dT) VN Primer为逆转录引物进行第一链cDNA的合成，并且利用逆转录酶的末端脱氧核苷转移酶 (TdT) 活性(Template-switching)，当逆转录酶到达RNA模板的5’端时，TdT活性在cDNA 3’端加上几个不依赖于模版的C碱基。在模板转换步骤，使用Template-switching oligo模板转换引物合成cDNA的第二链，最后，用反向基因特异性引物和正向TSO特异性引物进行PCR扩增以获得全长cDNA产物。

高效TSO接头连接效率（与Thermo Fisher Scientific比较）

使用TSO引物和AccelerRT^® 5G逆转录酶进行逆转录反应后，再用TSO引物与ACTB的R特异引物进行PCR扩增；或用ACTB的特异F引物与特异R引物进行PCR扩增。

图2. 使用TSO引物进行AccelerRT® 5G模板转换逆转录反应，所得cDNA分别以TSO引物5’端部分或基因特异上游和下游引物分别进行PCR扩增（A）。PCR扩增产物进行琼脂糖凝胶电泳（B），通过产物浓度密度值及产物长度计算TSO接头连接效率（表）。

图3. 使用AccelerRT® 5G Template Switching RT Enzyme Mix获得高效模板转换效率。分别以5G Template Switching RTase（PC020）和SuperScript IV RTase（Thermo Fisher #18090050）进行模板转换逆转录反应，所得cDNA分别以TSO引物5′ 端部分或基因特异上游和下游引物分别进行PCR扩增。PCR扩增产物进行琼脂糖凝胶电泳（C）。

具有宽广的温度稳定性

图4. AccelerRT^® 5G逆转录酶具有宽广的温度稳定性。使用AccelerRT^® 5G逆转录酶在42~60℃不同温度下，对1ng Hela total RNA进行反转录，随后对不同基因进行qPCR扩增。

灵敏度高

图5. 使用AccelerRT^® 5G逆转录酶，对1pg，10pg，100pg，1ng，10ng，100ng的Hela total RNA进行反转录，随后使用BlazeTaq™ SYBR® Green qPCR mix 2.0(Cat.# QP031)进行qPCR扩增。

高效逆转录效率

图6. 使用AccelerRT^® 5G逆转录酶，对1ng的Hela total RNA分别进行10min、15min、30min、60min反转录，随后使用BlazeTaq™ SYBR® Green qPCR mix 2.0(Cat.# QP031)进行qPCR扩增。

高效抗抑制性

图7.使用AccelerRT^® 5G逆转录酶，在不同抑制剂条件下对Hela total RNA分别反转录，随后使用BlazeTaq™ SYBR® Green qPCR mix 2.0(Cat.# QP031)进行qPCR扩增。

有效获得9.2 kb长度cDNA

图8. 使用AccelerRT^® 5G逆转录酶对Hela total RNA进行反转录，然后使用UltraHiPF™ DNA Polymerase Kit(Cat.# PC018)进行PCR扩增。

发现融合基因

图9. 使用AccelerRT^® 5G逆转录酶对H2228 total RNA进行反转录，然后使用UltraHiPF™ DNA Polymerase Kit(Cat.# PC018)，所得cDNA分别以TSO引物5’端部分和ALK基因特异反向引物进行半巣氏PCR扩增，得到EML4-ALK(E6;A20)融合类型片段约1.2kb（A）；将图A扩增产物用 EML4 正向引物与ALK反向引物进行扩增验证，得到片段800bp左右（B）。

* IP protected and AccelerRT® 5G Trademark owned by GeneCopoeia, Inc.

NileHiFi® Long Amplicon PCR Kit

dNTP Mixture

RNaseLock™ RNase Inhibitor