AviTag™ ORF cDNA clones, Protein Biotinylation

生物素连接酶

生物素连接酶（Biotin Ligase）由birA基因编码所得，能活化生物素形成生物素酰 -5′-腺苷酸，将生物素特异地转移到生物素受体标签蛋白（如AviTag 融合蛋白）上，使标签蛋白生物素化，也可用作生物素操纵子阻碍物。又名：生物素操纵子阻碍蛋白（biotin operon repressor protein）、bir A、生物素酶合成酶（biotin holoenzyme synthetase）、生物素-乙酰辅酶a羧化酶合成酶（biotin-[acetyl-CoA carboxylase] synthetase）。

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购买	货号	描述	规格	价格	说明书
	BI001	Biotin Ligase	20 μg×2, 300,000 U	￥1600

生物素连接酶预制稳转株

本产品由HEK293T细胞改造而来，稳定表达BirA。将带有Avi-tag的重组蛋白表达载体转染至本产品中，可以实现体内生物素化蛋白的表达；细胞内蛋白在独特的Avi-tag位点有效且特异性地被生物素化，大大降低了因为生物素化而引起的空间位阻效应，以避免影响蛋白生物学功能活性。

细胞系产品信息

货号	产品名称	宿主细胞	表达基因	筛选标记/标签	规格	Datasheet
SL241	Human cell line HEK293T stably expressing biotin ligase	HEK239T	BirA	Hygro / –	2×10⁶ cells/vial

生物素连接酶的相关菌株

购买	货号	描述	规格	价格
Biotinylation Strains
	AVB101	Efficient Biotinylation E. coli B Strain AVB101	1 vial, containing 0.5 mL of glycerol stock	￥2400
	AVB100	Efficient Biotinylation E. coli K12 Strain AVB100	1 vial, containing 0.5 mL of glycerol stock	￥2400

AVB 100菌株

AVB100是一种大肠杆菌E. coli K12菌株 [MC1061 araD139 delta(ara-leu)7696 delta(lac)l74 galU galK hsdR2(rK-mK+) mcrB1 rpsL(Strr)]。该菌株的染色体带有稳定转入的birA基因。

在该菌株中，BirA蛋白的过表达可由阿拉伯糖诱导所得。稳定转入的birA基因不需使用抗生素维持。在AVB100使用IPTG诱导的载体如Avidity’s pAC、pAN、pATN 和pATC AviTag载体，可独立调控目的基因及BirA的表达水平。该菌株仅限个人研究使用，不可分销，使用前请阅读产品的相关许可证明。

AVB99菌株

AVB99是一种带有pACYC184质粒的大肠杆菌E.coli (XL1-Blue)，该质粒包含IPTG诱导的birA基因，可过表达生物素连接酶(pBirAcm)，是一个低拷贝数的质粒。培养含该质粒的菌株可使用10 µg/mL浓度的氯霉素。

AVB101菌株

AVB101是大肠杆菌E. coli 的B菌株(hsdR, lon11, su1A1)，内含pACYC184质粒，该质粒含有IPTG诱导的birA基因，可过表达生物素连接酶(pBirAcm)。该菌株生长快速且健康，不含添加OmpT或Lon蛋白酶，是理想的蛋白表达工具菌株。

生物素连接酶及AviTag蛋白的表达均由IPTG (1 mM)诱导。诱导阶段必须添加生物素，添加至其终浓度为50 µM。pAN及pAC载体需添加氨苄青霉素维持，抗生素浓度建议为100 µg/mL。

Avidity’s AVB99及AVB101的质粒特性：

质粒骨架为pACYC184；
其中1.3 Kb片段含有插入了EcoRV位点的lacIq(因此可干扰tet^R基因)；
BirA由乳糖启动子操纵子调控表达；
rrnB终止子结构位于laqIq区域，可破坏pACYC184的XbaI位点。

AviTag 重组蛋白的体外生物素化

Biotinylated proteins visualized on a western blot with streptavidin-HRP conjugate and chemiluminescent substrate

图1 如图所示分为三组，分别将转染了 AviTag – eGFP 或 AviTag – IκBα 表达质粒的 293T 细胞提取物，以及未经转染的对照细胞提取物，与纯化的生物素连接酶、生物素（50 μM）和 ATP（10 mM）混合。经30℃（第1-7、9-13条泳道）或4 ℃ （第8、14条泳道）孵育30分钟后，通过SDS-PAGE电泳分离混合物。利用链霉亲和素 – HRP 偶联物和化学发光底物（Pierce），在蛋白质免疫印迹（western blot）上观察生物素化的蛋白质。

AviTag 重组蛋白的体内生物素化

图2 将 AviTag – eGFP 或 AviTag – IκBα 表达质粒单独转染到 293T 细胞中，或者分别与生物素连接酶共转染到293T细胞中。转染 13 小时后制备细胞裂解物。将细胞提取物在 12% 的 SDS – PAGE凝胶上进行分离。使用链霉亲和素 – HRP 偶联物和化学发光底物（Pierce），通过蛋白质免疫印迹（western blot）观察生物素化的蛋白质。

使用链霉亲和素磁珠沉淀生物素化的 AviTag 重组蛋白

图3 如图所示，用 AviTag 表达质粒与生物素连接酶的不同组合转染 293T 细胞。转染 24 小时后制备细胞裂解液，加入链霉亲和素磁珠后孵育 8 小时。悬浮液离心后，沉淀的磁珠进行三次洗涤。细胞裂解液（L）、上清液（S）以及与链霉亲和素磁珠结合的沉淀生物素化蛋白（B）经 SDS – PAGE分离。使用链霉亲和素 – HRP 偶联物和化学发光底物（Pierce），通过蛋白质免疫印迹（western blot）观察生物素化的蛋白质。

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