基因组编辑应用

TAL 效应子和 CRISPR-Cas9 体系都能用于细胞系或模式生物的精确基因组修饰实验 。具体的一些基因编辑应用请见下表。

TALEN 服务

TALEN是由TALE DNA结合结构域和FokI的DNA切割结构域融合构成。一对TALEN分别与两个相邻的靶点（相隔14-20bp）特异结合后，使得两个TALEN的FokI切割结构域靠近形成二聚体，发挥内切核酸酶活性，在两个靶位点之间剪切，产生双链断裂（DSBs）。DSBs诱发细胞内DNA损伤修复系统，非同源末端接合机制连接断裂的DNA时会产生碱基插入、缺失或者突变。另外，存在同源供体双链DNA片段时，同源重组可以将供体DNA整合进断裂位点。TALENs已用在人胚胎干细胞（ES）和诱导多功能干细胞（IPSCs）的基因修饰稳定株的制备，还用于大鼠，线虫，斑马鱼等基因敲出动物模型的构建。

.

图 3. TALEN设计示意图

图4. TALEN介导的基因敲除。 （左图） TALEN介导的DNA双链断裂（DSBs）被非同源末端修复机制修复（NHEJ）。 （右图） TALEN介导的DNA双链断裂（DSBs）通过同源重组（HR）敲入供体质粒上的选择标记（或其他遗传因子）修复。

图 5. EGFP-TALENs体外切割靶DNA. (A) EGFP TALEN 靶向质粒(6110 bp) 含有一个EcoRI 酶切位点和一个eGFP TALENs的切割位点，相隔约1066 bp. (B)用相应的的酶（EcoRI或者EGFP-TALENs）和 1 µg 靶向质粒37°C孵育30 分钟后， 取一半的反应产物（约500 ng DNA）进行琼脂糖凝胶电泳。结果表明EGFP-TALENs特异切割靶向质粒。*号所指的DNA片段通过PCR验证（未展示数据）

图 6. EGFP TALENs 下调靶基因eGFP的表达. (A) eGFP TALENs 表达检测：转染eGFP TALEN质粒到HEK293T细胞中（6孔板，转染0.8 µg质粒每孔)。 48小时后收集细胞，通过western blot检测EGFP-TALENs的表达（Flag标签抗体， SDS-PAGE分离胶浓度为8%，EGFP-TALEN分子量约110kDa）。 (B) EGFP TALENs 下调靶基因eGFP的表达: 共转染EGFP TALENs质粒和EX-EGFP-Lv105 (eGFP表达克隆)到6孔板中的HEK293T 细胞中。48小时后在显微镜下观察EGFP的表达水平。(Nikon Eclipse Ti, 曝光时间: 600ms)。.

(A)

*靶向报告质粒中的Gluc报告基因中插入了TALEN靶点-终止密码子序列， 产生无义突变，不能表达Gluc。 **供体质粒中的野生型Gluc上游没有启动子，也不能表达Gluc。该野生型的Gluc可通过同源重组修复靶向报告质粒中的发生双链断裂的无义突变的Gluc（上游含CMV启动子），恢复Gluc的表达。

(B)

图 7. TALENs 促进同源重组 共转染eGFP-TALENs (1 µg)、靶向报告质粒 (0.5 µg) 和供体质粒 (0.5 µg)到HEK293T细胞中（6孔板）。 48小时后，检测同源重组修复Gluc的表达水平，以报告质粒中内参基因SEAP做校正因子。

TALEs的一个重要应用是通过TALE DNA结合结构域与转录调控结构域融合，靶向激活或抑制细胞内靶基因的表达。TALE-TF结构是真核细胞内选择性调节基因表达的高度特异性的强大的工具。TALE-TF由TALE DNA结合结构域和VP64 转录激活子融合而成，可对真核细胞内靶基因进行精确激活。

图 8. TALE-TF设计示意图

图 9. NTF3 TALE-TF 上调内源性NTF3的转录。转染 NTF3 TALE-TF到HEK293T细胞中 (6 孔板, 每孔转染1 µg 质粒) 。实时荧光定量PCR检测表明TALE-TF将HEK293T细胞内NTF3的表达水平提高了17倍左右（以空载体做对照）。

图 10. 合成的TALE激活因子对人类基因表达具有协同作用：(a) 一个TALE结构图。每个重复单元里被标出的氨基酸可识别以下碱基。NLS：核定位序列；VP64/p65：激活区（ADs）。(b) 单一TALE以不同效率诱导靶标人类基因表达。 (c) 定点作用于任一DNA单链的TALEs可协同作用，有效地提高诱导率。(Nature Methods. 2013 Vol. 10. No. 3: 207-208)

TALE定制服务

GeneCopoeia提供TALENs,TALE-TFs和其他基于TALE的靶向基因组修饰因子的设计，构建和验证服务。

优点

相关服务

供体载体类型

载体	启动子	报告基因	筛选标记	LoxP 位点	载体图谱
pDonor-D01	EF1a	copGFP	Puromycin	N/A
pDonor-D02	CMV	copGFP	Neomycin	N/A
pDonor-D03	CMV	N/A	Neomycin	N/A
pDonor-D04	CMV	N/A	Puromycin	N/A
pDonor-D05	EF1a	N/A	Neomycin	N/A
pDonor-D07	EF1a	copGFP	Puromycin/TK	LoxP
pDonor-D08	CMV	copGFP	Neomycin/TK	LoxP
pDonor-D09	EF1a	N/A	Puromycin/TK	LoxP
pDonor-D10	CMV	N/A	Neomycin/TK	LoxP
pDonor-D11	PGK	copGFP	Puromycin/TK	LoxP
pDonor-D12	EF1a	copGFP	Hygromycin/TK	LoxP
pDonor-D13	PGK	copGFP	Neomycin/TK	LoxP
pDonor-D14	PGK	N/A	Puromycin/TK	LoxP

用户手册

Genome-TALER™ TALEN 及 TALE-TF 产品和服务 用户手册

FAQs

基因组编辑常见问题及 TALEN & TALE-TF FAQ

技术说明

Knockout by TALEN or CRISPR vs knockdown by shRNA or siRNA

CRISPR-Cas9 specificity: Taming off-targent mutagenesis

Genome editing: Which should I choose, TALEN or CRISPR?

Genome editing in mammalian cells: What do I do next?

Genome editing: check out these exciting donor clone applications! 

应用说明

GeneCopoeia genome editing tools for safe harbor integration in mice and humans

综述文章

Genome Editing Technology from GeneCopoeia

IndelCheck™ CRISPR/TALEN 插入缺失检测体系及染色体水平功能验证服务 – GeneCopoeia 开发的 IndelCheck™ CRISPR/TALEN 插入缺失检测体系能用于 CRISPR/TALEN 的染色体水平功能验证及基因敲除细胞系筛选。我们同时也提供提供 CRISPR/TALEN 染色体水平功能验证服务。

供体克隆定制及载体服务– GeneCopoeia提供标准或客户定制的供体克隆载体，用于基因敲除、突变修饰、融合标签及其他方面的应用。我们提供带有不同元件的多种载体骨架，可供客户根据自己的实验需要进行选择。

基因组编辑稳定细胞系构建服务 – GeneCopoeia提供使用TALEN或CRISPR-Cas9技术构建的基因组编辑稳定细胞系。我们的稳定细胞系服务也可以兼容我们的人类及小鼠safe harbor基因敲入体系。

转基因小鼠服务 – GeneCopeia 提供原核显微注射法生成的带有 CRISPR 或 TALEN 介导的基因组修饰小鼠。

GeneHero™ CRISPR-Cas9 产品及服务——GeneCopoeia提供CRISPR-Cas9 sgRNA 设计及克隆服务，Cas9表达克隆和其他相关产品及服务，为客户实现简便快捷的靶向基因组编辑。

Genome-TALER™ 及 GeneHero™ 人类 AAVS1 Safe Harbor 基因敲入试剂盒及敲入克隆——试剂盒能通过 TALEN 或 CRISPR-Cas9 介导，将您的目的基因、筛选标记及其他遗传因子特异敲入人类第19号染色体上的 AAVS1 safe harbor 位点。我们有超过20,000条经过序列确证的人类ORF可用于构建 AAVS1 ORF 供体克隆。AAVS1 位点的安全整合能保证敲入基因被正常转录，并对细胞无已知的副作用

Genome-TALER™ 及 GeneHero™ 小鼠 ROSA26 safe harbor 基因敲入试剂盒及敲入克隆——试剂盒能通过 TALEN 或 CRISPR-Cas9 介导，将您的目的基因、筛选标记或其他遗传因子特异敲入小鼠基因组中的 ROSA26 safe harbor 位点。这样的安全敲入能保证转入基因的转录活性，并对细胞无已知的副作用。