技术简介
GeneCopoeia 开发的 IndelCheck™ CRISPR/TALEN 插入缺失检测体系能为您的基因组编辑研究提供强大的助力。 IndelCheck 检测 体系主要可用于以下两方面应用：
CRISPR sgRNA 或 TALEN 功能验证 （图 1 ） ：在进行需时较长的基因组编辑项目之前（基因组编辑细胞株通常需时3-6个月，基因组编辑小鼠模型通常需时6-9个月），先进行功能验证预实验能排除剪切效率不佳的 CRISPR sgRNA 或 TALEN设计，节省大量实验时间。筛选基因敲除或敲入阳性的单克隆细胞株 （图 2 ）。
优势
简化您的 CRISPR/TALEN 功能验证及基因敲除克隆筛选
靶点序列 PCR 扩增能力强大，无需分离基因组
优化过的 T7 核酸内切酶 I 检测系统，含阳性对照，易于上手
图 1. 使用IndelCheck™体系对 CRISPR 或 TALEN 进行功能验证。 收集经 CRISPR 或 TALEN 转染的细胞，并针对靶点序列设计引物，使用靶点 PCR 试剂盒（1）扩增经过 CRISPR/TALEN 扩增的靶点序列。所得的 PCR 产物经解链退火生成杂交 DNA 双链产物，其中部分部分可能存在错配，可以被 T7 核酸内切酶 I 试剂盒（2）酶切检出。如果 CRISPR/TALEN 对基因组的编辑功能是阳性的，错配酶切所产生的条带可以通过电泳跑胶观察到。
图 2. 使用 IndelCheck™ 体系筛选带有目的基因组修饰的单克隆细胞株。接种经 CRISPR 或 TALEN 转染的细胞并挑取单克隆细胞株，然后针对靶点序列设计引物，使用靶点 PCR 试剂盒（1）扩增经过 CRISPR/TALEN 扩增的靶点序列。左侧 的流程用于筛选非同源末端连接（NHEJ）机制介导的基因敲除克隆，利用 T7 核酸内切酶 I 检测试剂盒（2）对靶点 PCR 产物进行错配酶切，检测NHEJ机制引入的插入缺失突变；检测阳性的 PCR 产物通过靶点 PCR 克隆试剂盒（3）装载体送测，对引入的突变进行测序确证。右侧 的流程用于鉴别基因敲除或基因敲入修饰，使用靶点 PCR 克隆试剂盒（3）将靶点 PCR 产物装载体送测，检测和确证靶点引入的基因组修饰。
以下图片是使用 IndelCheck™ 靶点 PCR 试剂盒及 T7 核酸内切酶 I 检测试剂盒进行的一个典型的功能验证实验的结果：
图 3. T7 核酸内切酶 I 酶切基因组PCR产物。该基因组经CRISPR-Cas9编辑。 对照细胞（-）的酶切产物应只有一条带，对应没有被切开的基因组PCR产物。转染了有活性的CRISPR-Cas9克隆的实验组（+），酶切产物跑胶出现3条带：1条来自未被编辑的细胞的基因组PCR产物，其余两条较短的条带为长度符合预期的错配酶切产物。
图 4. Smart-Join™ Blunt-end PCR Cloning Kit的性能比较。 将多组不同长度的PCR产物进行连接反应并转化涂板，然后检测菌落总数和阳性率。 显示SmartJoin™ Target Site PCR Cloning Kit（GeneCopoeia, Cat.No.IC007）的连接效率与Zero Blunt™ PCR Cloning Kit（Thermo Fisher, Cat.No.K275020）相当。
图 5. 多组Control Insert连接产物凝胶电泳图
资源 用户手册
用户手册2.0版
用户手册1.0版
SmartJoin™-Target-Site-PCR-Cloning-Kit说明书
MSDS
IndelCheck™ 检测体系物料安全数据表 （1.0版）
技术说明
IndelCheck™: A Powerful CRISPR/TALEN Validation & SCreening Tool
FAQs
答： a) 转染效率。如果 CRISPR 或 TALEN 质粒进入的细胞所占的比例很低，那试剂盒检测到修饰的几率也会相应降低。b) 靶点 PCR 的效率。如果 PCR 产量低，您需要保证酶切和上样量里有足够的错配 DNA 才能观察到剪切条带。如果 PCR 产量不足，您需要扩大反应体系并浓缩产物。同样重要的还有当您进行错配酶切产物跑胶时，T7 核酸内切酶 I 产物样品与未经酶切的对照样品 DNA 总量要保持一致。
答： 该阳性对照是两个部分错配的模板以及一对引物的混合物。在完成基因组 PCR 扩增后，您可以将这个对照的 520 bp 扩增产物进行解链和退火，从而生成带有错配的杂合 DNA，然后将这个产物用作酶切底物。T7 核酸内切酶 I 能够识别并剪切错配杂合 DNA，生成分别为 180 bp 和 340 bp 长的两个酶切片段。 这两个片段可以通过 2% 琼脂糖凝胶分离。
答： 我们的试剂盒适用于扩增大小在 3000 bp 以内的靶点序列。（我们测试时的最长扩到 2500 bp，但并没有进一步试验扩增更大的片段）。如果您是希望为随后的克隆准备 PCR 扩增产物，我们建议您使用更高保真性的 DNA 聚合酶——如UltraPF——来进行。在为您的基因组 DNA 扩增设计特异引物时，我们建议您将 Tm 值设在 62℃ 以上。
答： 试剂盒默认是不包含靶点特异 PCR 引物的。您可以选择在订购试剂盒或其他 CRISPR/TALEN 试剂的同时订购该引物。我们会收取相应的费用。
答： 不需要。这套错配酶切检测体系除了可以在分离单克隆细胞系后用来筛选插入缺失修饰阳性的克隆，还能在分离单克隆细胞系前对 CRISPR 或 TALEN 进行功能验证。
答： 可以。不过所得的结果应该根据转染效率进行调整。例如，如果你的跑胶结果显示的剪切效率为 25%，而你的转染效率是 50%，那实际上的剪切效率约有 50%。此外，点样时要注意对照孔加入的未经酶切的 DNA 量应与样品孔的 T7 核酸内切酶 I 酶切产物 DNA 量保持一致。
相关服务 GeneCopoeia 也提供 CRISPR/TALEN 验证服务。该染色体水平验证服务使用 IndelCheck™ CRISPR/TALEN 插入缺失检测体系。我们会在HEK293细胞系（人类）、NIH3T3细胞系（小鼠）或您所指定的细胞系中验证您从我们这里订购的CRISPR/TALEN克隆的功能。联系本服务请致信 inquiry@igenebio.com 或致电 4006-020-200.
GeneHero™ CRISPR 产品及服务 Genome-TALER™ TALEN 和 TALE定制服务
